Como melómano empedernido Carlos V disfrutó con la música, por un lado la nueva y desconocida música tocada con exóticos instrumentos por los moriscos granadinos, por otro la mas conocida música castellana de vihuela, sin dejar de lado la de los músicos de la corte de su mujer, o la suya propia neerlandesa, tocada por sus dos capillas musicales bruselenses que le acompañaron.
La música sagrada de los polifonistas de la época imperal de Carlos V, fue una afloración portentosa del alma española del siglo XVI, inflamada por la llama religiosa que movía los actos de reyes y obispos, de ascetas y artistas españoles, maestros en la estética humana y espiritual.
Los estudios realizados hasta hoy permiten afirmar que en la España de Carlos V florecieron principalmente tres escuelas de polifonía sagrada: la andaluza, con su centro en Sevilla; la castellana con la capilla de Ciudad Real, Toledo y Burgos; y la catalana, cobijada en sus catedrales

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El cultivo del madrigal y de la canción profana polifónica en la España de Carlos V, señala que, en lo concerniente a la canción profana polifónica, hubo dos corrientes: por una parte Castilla continuo practicando las formas típicas del villancico, la canción y el soneto, siguiendo la técnica simplísima y la estética tan características del villancico y de la canción polifónica amorosa, cultivada en la Corte de los Reyes Católicos; por otra se presento Cataluña cultivando de lleno la música programática y descriptiva de los franceses y la forma madrigalesca de los italianos.
De los grandes maestros del siglo XVI destacamos a Antonio Cabezón (1510-1566) por su condición de músico de cámara de Carlos V y organista de Felipe II. Dedico su obra al órgano y al clavicordio, logrando composiciones de gran belleza musical, en base a pequeñas variaciones que fueron un adelanto de lo que la variación melódica llegaría a ser. Su influencia en la música internacional posterior fue enorme y es, por ello, una figura de primer orden.